Oznaczanie stężenia hemoglobiny (HGB) we krwi
(metodą cyjanomethemoglobinową).
Hemoglobina główny składnik erytrocytów jest głównym transporterem tlenu z płuc
do tkanek. Prawidłowe stężenie hemoglobiny we krwi gwarantuje prawidłowe zaopatrzenie
komórek w tlen. Do oznaczania stężenia hemoglobiny we krwi stosowana jest metoda
kolorymetryczna z zastosowaniem odczynnika Drabkina. Odczynnik Drabkina zawiera
sześciocyjanożelazian potasowy i cyjanek potasowy, który przekształca hemoglobinę w
cyjanmethemoglobinę, o brunatno-czerwonym trwałym zabarwieniu. Intensywność
zabarwienia zależy od stężenia hemoglobiny we krwi.


Wykonanie
Do wykonania potrzebne są: krew żylna, spektrofotometr, odczynnik Drabkina,
wzorcowy roztwór cyjanmethemoglobiny, kuwety, probowki, pipety.
Do 2 probówek odmierzyć po 2,5 ml odczynnika Drabkina i 10uL krwi, wymieszać i
pozostawić na 15 minut. Po tym czsie należy zmierzyć ekstynkcję roztworu badanego (E próby)
i ekstynkcję roztworu wzorcowego ( E wzorca ). Na podstawie uzyskanych wartości E próby i E wzorca obliczyć ilość gramów hemoglobiny
we krwi badanej.
[Hb g/dL] = E próby x współczynnik danej serii roztworu wzorcowego E wzorca
Otrzymany wynik przeliczyć na mmol/l
.......g/dL x 0,62 = .......mmol/L

Oznaczanie hematokrytu (HCT) metodą mikrohematokrytową
Wskaźnik hematokrytu jest liczbą wyrażającą stosunek objętości elementów
morfotycznych krwi do objętości krwi pełnej. Wartość hematokrytu zależy głównie od ilości
erytrocytów oraz ich wielkości. Tylko jeden procent wskaźnika hematokrytu przypada na
leukocyty i trombocyty. Wyznaczenie wskaźnika hematokrytu wykonuje się w wirówce
hematokrytowej w której uzyskuje się odpowiednią siłę odśrodkową.
Zadanie
Oznaczyć wskaźnik hematokrytu badanej krwi.
Wykonanie
Potrzebne do wykonania są: krew żylna wersenianowa, kapilara hematokrytowa,
wirówka mikrohematokrytowa.
Po zdjęciu pokrywy wirówki odsłania się rotor zawierający 20 gniazd na kapilary.
Kapilary napełnione krwią do 3/4 długości i zatopione dokładnie od wolnej strony w małym
płomieniu palnika gazowego, albo zatkane woskiem, umieszcza się w gniazdach rotora
wirówki zatopionym końcem na obwód. Rurki należy umieszczać w ten sposób w gniazdach,
aby równoważyły się wzajemnie. Następnie nakłada się pokrywę ze śrubą, którą dokładnie się
dokręca. Następnie wciska się klawisz start. Wirówka zatrzymuje się samoczynnie. Nie
należy otwierać wirówki zanim nie ustanie ruch rotora.
Do odczytywania wartości wskaźnika hematokrytu służy specjalny czytnik. W tym celu
należy:
- kapilarę umieścić w rowku ruchomej pionowej listwy tak aby dolny koniec krwi
znajdował się na linii poziomej i przesunąć maksymalnie w prawo;
- ruchomą ukośną miarkę należy ustawić tak, aby zaznaczona na niej linia znajdowała się
na granicy krwi;
- listwę z umieszczoną kapilarą, należy przesunąć w lewo do momentu, kiedy linia miarki
znajduje się na granicy osocza i elementów morfotycznych;
- odczytać na skali wielkość wskaźnika hematokrytu w procentach.
Otrzymany wynik należy pomnożyć przez 0,95 ponieważ 5% wysokości słupa odwirowanych
elementów morfotycznych krwi osocze uwięzione pomiędzy krwinkami.

Obliczanie średniej objętości erytrocytu (MCV), średniej masy hemoglobiny
(MCH) i średniego stężenia hemoglobiny w erytrocycie (MCHC).
Ważną informacją diagnostyczną układu czerwonokrwinkowego są wskaźniki które
można obliczyć na podstawie parametrów oznaczanych.
Średnia objętość prawidłowych erytrocytów jest wartością stałą. W pewnych
zaburzeniach hematologicznych mogą występować krwinki o większej objętości- makrocyty,
a w innych o mniejszej objętości- mikrocyty. Również średnia masa hemoglobiny i średnie
stężenie hemoglobiny mogą dostarczać informacji diagnostycznych.
MCV (fL) = [Ht x 1000] : RBC/L =
MCH (pg) = [Hb (g/dL) x 10] : RBC (w mln/L)=
MCHC (g/dL) = Hb(g/dL): Ht =

Oglądanie i liczenie erytrocytów (RBC) i leukocytów (WBC) w komorze Bürkera
Obecnie w praktyce laboratoryjnej do oznaczania liczby poszczególnych rodzajów
krwinek stosuje się stosowane są analizatory hematologiczne. Metoda komorowa obecnie
stosowana jest jedynie do kalibracji innych metod, ponieważ jest metodą pracochłonną i
czasochłonną.
Komora Bürkera jest podobna do szkiełka podstawowego. Na szkiełku pomiędzy
dwoma rowkami nacięta jest "siatka Bürkera", która składa się z odpowiedniej wielkości
kwadratów i prostokątów przeznaczonych do liczenia poszczególnych rodzajów krwinek:
małe kwadraty- erytrocytów, duże kwadraty- leukocytów, prostokąty- płytek krwi.
Zadanie. Obejrzeć pod mikroskopem komorę Bürkera. Policzyć ile jest średnio erytrocytów
i leukocytów w odpowiednich kwadratach oraz ich ilość w 1 uL krwi.
Wykonanie
1. Do probówek odmierzyć odpowiednie ilości roztworów do liczenia krwinek:
- erytrocytów (RBC) - 4 mL płynu cytrynianowo-formolowego.
- leukocytów (WBC) - 380 uL płynu Türka.
2. Pobrać pipetą po 20 uL krwi badanej i przenieść do probówek z odmierzonymi
odczynnikami i wymieszać.
3. Obejrzeć czystą komorę pod mikroskopem. Ustawić tak aby były widoczne ostro linie
siatki pod obiektywem 10x i rozpoznać kwadraty w których liczy się poszczególne
rodzaje krwinek ( erytrocyty - małe kwadraty; leukocyty- duże kwadraty )
4. Na komorę Bürkera nałożyć szkiełko nakrywkowe.
5. Nanieść zawiesinę krwinek przy brzegu szkiełka nakrywkowego. Płyn na skutek
działania sił włosowatości wypełni komorę pod szkiełkiem nakrywkowym.
6. Położyć komorę na stoliku mikroskopu i ponownie ustawić ostrość tak aby były widoczne
zarówno linie siatki jak i krwinki.
7. Policzyć ile średnio krwinek znajduje się w poszczególnych kwadratach.
Należy liczyć tylko krwinki znajdujące się wewnątrz kwadratu nie dotykające żadnego
boku i dotykające dwóch boków; dotykające dwóch kolejnych pomijamy.
W celach diagnostycznych WBC liczy się w 80, a leukocyty w 125 kwadratach.

Erytrocyty (RBC) - średnią ilość należy pomnożyć przez 1/4000 (objętość 1 kwadratu) i
przez 200 (rozcieńczenie krwi).
RBC w uL = ......... x 800.000 = ............
Leukocyty (WBC) - średnią ilość należy pomnożyć przez objętość 1 kwadratu (1/250)
i przez rozcieńczenie (20).
WBC w uL = ....... x 5 000 = ..........

Oznaczanie krwinek płytkowych (PLT)
Krew rozcieńcza się płynem który utrwala krwinki płytkowe a rozpuszcza erytrocyty i leukocyty. Roztwór umieszcza się na płytce i umieszcza pod mikroskopem fazowo-kontrastowym. Płytki przedstawiają się w postaci błyszczących elementów.
Odczynniki: formaldehyd - 0,5ml, aceton- 2,5ml, NaCl 0,9%- 10ml, woda destylowana do 100ml.
Krew pobiera się do mieszalnika do liczenia erytrocytów do kreski 1,0. Następnie uzupełnia się mieszalnik płynem rozcieńczającym do kolejnej kreski - 101, otrzymuje się w ten sposób rozcieńczenie krwi 1:100. Mieszalnik wstrząsa się przez 3 min a następnie odkłada na 30 minut. Po tym czasie ponownie się wstrząsa i napełnia kamerą do liczenia krwinek którą umieszcza się w szalce Petriego na 15 minut by płytki opadły na dno kamery. Kamerę umieszcza się w mikroskopie i liczy krwinki płytkowe na dużych kwadratach siatki (jak krwinki białe) stosując obiektyw PH20 i okular x15. Krwinki płytkowe są widoczne jako drobne, kuliste, świecące punkty.
Obliczenia:
ilość płytek w 1uL krwi= Ax100x10
A- ilość płytek policzonych w 0,1mm3
100- rozcieńczenie krwi
Krew u małych dzieci lub osób u których niemożliwe jest pobranie krwi żylnej, krew pobiera się z nakłucia palca. Stosuje się wtedy płyn rozcieńczający o skłądzie: chlorowodorek kokainy- 3,0g, chlorek sodowy- 2g, woda destylowana do 100,0ml. Dalsze postępowanie jak powyżej.