Witam.
Mam pytanie odnośnie praktycznej strony oznaczania stężenia białek metodą Bradforda. Jakim błędem jest obarczona ta metoda i w zakresie jakich stężeń białka jest ona stosowalna.
Natrafiłem na kilka informacji w tym zakresie, nie do końca ze sobą zgodnych, dlatego pytam praktyków stosujących tego typu oznaczenie. Jakie znaczenie mają ilości użytych reagentów (roztwór białka:barwnika).
Ja stosuję 100 mikrolitrów roztworu białka (bufor PBS, stężenie do 0.0005 g/ml) i 900 mikrolitrów odczynnika Bradford. Analiza po 10 minutach przy długości fali 595nm. Nierzadko otrzymuję wyniki z tej samej próbki które znacznie się od siebie różnią.
Liczę, że ktoś ma do czynienia z takimi analizami i podrzuci parę dobrych rad.

Zmień metodę )). A tak na poważnie, jak dla mnie metoda jest bardzo chimeryczna. Rutynowo robimy ją ze studentami na zajęciach (na trochę bardziej zaawansowanym kursie niż podstawowa biochemia, bo tam to jednak króluje Lowry). Met. Bradforda stosowałem w zakresie od 0,1 - 1,0 mg/mL (albumina jako standard). Wychodziło różnie, kwadratowo i podłużnie - że tak to określę . Zdarzało mi się że mi się ostatnie 2-3 punkty krzywej się "wypłaszczały". W każdym bądź razie lepiej nam wychodziło w większej ilości odczynnika B. - bodajże 50uL próbki na 2,5 mL odczynnika, ale i tak zdarzało się że absorbancje nam się rozbiegały w różne strony. Nie wiem jak zachowuje się handlowa wersja odczynnika, bo u nas robimy go sami.
Osobiście wolę pracować na sigmowskim BCA, bo mam pewność że mi wszystko powtarzalnie wyjdzie. Póki co z tym zestawem do oznaczania białka nie miałem żadnych problemów.

Wielkie dzięki, trochę mnie to podniosło na duchu, bo niektóre wyniki rzeczywiście lekko mnie zaskakiwały.
Może warto będzie jednak przerzucić się na BCA...

Dla większości oznaczeń BCA spokojnie wystarcza i jest całkiem precyzyjne . Jednak zanim zaczniesz korzystać z tej metody przeglądnij sobie tabele zgodności dla poszczególnych związków - zarówno dla BCA i dla Bradforda są one dostępne na końcu instrukcji sigmowskiej.

Chyba nie powinno być żadnych problemów ze stosowaniem tej metody u mnie, oznaczam lipazę w PBS-ie więc nic tam nie powinno przeszkadzać. Dzięki, pozdrawiam